polylc 聚磺乙基簡(jiǎn)介
聚磺乙基 A™
- 用于肽的陽(yáng)離子交換-
這種強(qiáng)陽(yáng)離子交換 (SCX) 材料是專門為多肽的 HPLC 開發(fā)的。在 pH 2.7-3.0 時(shí)，肽會(huì)失去 (-) 電荷并具有凈 (+) 電荷。因此，PolySULFOETHYLA™是反相 (RPC) 的通用替代品，通過(guò)電荷差異而不是極性來(lái)分離肽。與其他基于磺丙基 (SP-) 基團(tuán)的 SCX 材料相比，PolySULFOETHYLA™是異常親水的。這最大限度地減少了與肽的疏水相互作用，具有高回收率和更少的峰拖尾。容量也很高，可以更好地保留和分離胰蛋白酶消化物中的弱堿性肽。這種離子交換材料的容量是同類 RPC 柱的 4 倍。因此，離子交換應(yīng)該是多步純化的第一步。將聚磺乙基 A™ 用于：
1) 多肽混合物的多維 HPLC，例如 蛋白質(zhì)組學(xué)分析中的胰蛋白酶消化物（包括 iTRAQ® 和 ICAT®* 反應(yīng)產(chǎn)物）。
2) 從天然產(chǎn)物中分離肽。
3) 合成肽的QC和純化。
4) 從胰蛋白酶消化物中選擇性分離二硫鍵連接的肽、磷酸肽和 C 端片段。
5) 肽消化物圖譜（胰蛋白酶、V8、CNBr 等）。
蛋白質(zhì)也可以在PolySULFOETHYL A™色譜柱上運(yùn)行；在 pH 值為 3 時(shí)，幾乎可以保證保留。一個(gè)例子是在以親水相互作用(HILIC) 模式操作的 PolySULFOETHYL A 色譜柱上分析肺表面活性劑蛋白。
肽應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)材料是 300-?，3- 或 5-µm。200-? 材料的容量增加約 25%，是 iTRAQ® 反應(yīng)混合物的磷酸肽分離和分級(jí)分離的優(yōu)選。對(duì)于蛋白質(zhì)，使用 1000-? 材料或 3-µm、1500-? 材料。
蛋白質(zhì)組學(xué)
胰蛋白酶消化物的 SCX-RPC： 沒有單一的分析方法足以識(shí)別一個(gè)非常大的集合中的每個(gè)蛋白質(zhì)。一種廣泛使用的方法（自下而上"蛋白質(zhì)組學(xué)）是用胰蛋白酶消化混合物中的所有蛋白質(zhì)，并將所得肽分成足夠小的組，以便通過(guò) MS/MS 或 QTOF-MS 進(jìn)行鑒定。對(duì)于少于 200 個(gè)肽段的樣品，反相 HPLC 通?？梢蕴峁┳銐虻姆直媛剩^大的樣品必須首先通過(guò)補(bǔ)充方法分成子集。實(shí)現(xiàn)此目的的最佳方法是使用強(qiáng)陽(yáng)離子交換 (SCX)通過(guò)荷質(zhì)比的差異將消化物分成幾部分。然后可以通過(guò) RPC-MS 分別分析每個(gè) SCX 餾分。該序列已用于鑒定樣品中多達(dá) 12,000 個(gè)肽段。我們的聚磺乙基天冬酰胺™材料是好的，大多數(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)室都在使用。最好在 pH 2.7-3.0 的鹽梯度下進(jìn)行，此時(shí)羧基失去負(fù)電荷，幾乎所有肽都帶凈 + 電荷。在典型的復(fù)雜胰蛋白酶消化中，大約 65% 的肽具有 +2 的凈電荷（由于堿性 N 末端和 C 末端的 Lys- 或 Arg-）。線性鹽梯度會(huì)導(dǎo)致這些洗脫物聚集在幾個(gè)餾分中，從而破壞了色譜第二維的目的。相反，使用 2 段線性梯度洗脫色譜柱；在大部分梯度時(shí)間內(nèi)使用淺梯度（至約 180 mM 鹽）以分散 +1 和 +2 肽，并使用陡峭梯度至約 0.5 M 鹽以洗脫 +3 和 +4 肽。
在線與離線 SCX 分餾：PolySULFOETHYL A™填充毛細(xì)管可以通過(guò)增加鹽濃度的步驟進(jìn)行洗脫，每個(gè)餾分進(jìn)入脫鹽 RPC 捕集柱或直接進(jìn)入 RPC 毛細(xì)管。這種安排通常稱為MuDPIT。另一種方法是離線收集餾分，然后將它們分別注入 RPC 毛細(xì)管（“分離的MuDPIT "）。
在線優(yōu)勢(shì)：更容易處理極小樣本并實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。
離線優(yōu)勢(shì)：
1) 可以用更簡(jiǎn)單的設(shè)備進(jìn)行。
2) 流動(dòng)相可以含有 20-25% ACN，可以在 RPC 步驟之前去除。這提供了更尖銳的峰。結(jié)果：更高百分比的肽在單個(gè)收集的級(jí)分中洗脫，而不是在兩個(gè)相鄰級(jí)分之間分離（在有利的情況下，> 75% 的總肽在真正復(fù)雜的胰蛋白酶消化物中）。這增加了肽段鑒定的成功率，因?yàn)槟锌赡茉趩蝹€(gè)部分中獲得可檢測(cè)量（~ 15 fmol）的低豐度肽，并且不太可能與來(lái)自高豐度的肽共享該部分蛋白質(zhì)（可以抑制其在 MS 步驟中的電離）。
3) SCX 色譜柱可以比 RPC 毛細(xì)管大。這允許加載更多樣品，從而更有可能檢測(cè)到 > 15 fmol 的每種肽。它還允許使用更快的流速。這有助于收集大量餾分（在某些實(shí)驗(yàn)室多達(dá) 100 個(gè)）。這反過(guò)來(lái)又增加了識(shí)別低豐度肽的機(jī)會(huì)，因?yàn)樗鼈儾惶赡芘c高豐度肽共享一部分。例如，甘等人。( Proteomics 5 (2005) 2468) 通過(guò)收集 40 個(gè) SCX 級(jí)分鑒定出比收集 25 個(gè) SCX 級(jí)分多 2.8 倍的蛋白質(zhì)。
4) 可以使用線性梯度代替階梯梯度。這增加了分辨率。
結(jié)論：離線餾分收集是*的。Kevin Blackburn (NC St. U) 表示*，他通過(guò)離線餾分收集識(shí)別出的肽比在線多 3 倍，所有增加的肽都代表低豐度的肽。
*（ASMS '00 和 '01）。
完整蛋白質(zhì)的預(yù)消化分餾：這在以下幾種情況下非常有用：
1) 樣品中的蛋白質(zhì)太多，即使是 SCX-RPC 的 2-D 組合也不足以充分分餾胰蛋白酶消化物以識(shí)別低豐度肽。
2) 樣品中含有一些豐度比其他蛋白質(zhì)高得多的蛋白質(zhì)。將它們收集在它們自己的部分中將排除它們的胰蛋白酶片段掩蓋來(lái)自低豐度蛋白質(zhì)的肽。請(qǐng)參見下面的 THP-1 單核細(xì)胞示例。
3）雖然蛋白質(zhì)的數(shù)量有限，感興趣的蛋白質(zhì)豐度低，如果在消化前不與高豐度蛋白質(zhì)分離，就會(huì)被掩蓋。參見組蛋白 H4 和 H1.5 的示例。
4) 在消化前將蛋白質(zhì)分配到組分中增加了通過(guò)一種以上肽識(shí)別特定蛋白質(zhì)的機(jī)會(huì)。請(qǐng)參見以下示意圖：
用于此目的的通用方法包括疏水相互作用 (HIC) 和離子交換 (IEX) 色譜法。HIC 是一種通過(guò)疏水性差異分離水溶性蛋白質(zhì)的好方法 [下]。與反相色譜不同，它是一種非變性模式。然而，疏水蛋白很難在 HIC 中保持在溶液中。
相比之下，IEX 可以在流動(dòng)相中使用有機(jī)溶劑進(jìn)行，使其與所有蛋白質(zhì)具有前瞻性兼容。參見蛋白質(zhì)與有機(jī)溶劑的離子交換。
串聯(lián)使用陰離子交換柱和陽(yáng)離子交換柱會(huì)產(chǎn)生保留所有蛋白質(zhì)的混合床排列。下面的示例是 THP-1 單核細(xì)胞沉淀的粗裂解物，使用PolyCAT A™和PolyWAX LP™色譜柱獲得。具有揮發(fā)性鹽的梯度是可能的。
膜蛋白的HILIC：HILIC 對(duì)膜蛋白非常有效，如下例所示。有時(shí)可以使用揮發(fā)性溶劑。組蛋白最好在HILIC 模式下使用PolyCAT A™色譜柱進(jìn)行分離。
從胰蛋白酶消化物中分離磷酸肽和其他類型的肽：由于 N 端和 C 端的 Lys 或 Arg 殘基，典型的胰蛋白酶肽在 pH 2.7-3.0 時(shí)具有 +2 的凈電荷。磷酸基團(tuán)的連接將肽的凈電荷降低至+1。因此，最早洗脫的 SCX 級(jí)分富含磷酸肽，以及 C 端和封閉的 N 端片段。PolySULFOETHYL A™的 200-? 孔徑版本比通常用于蛋白質(zhì)組學(xué)的 300-? 材料具有更高的表面積，并且可以合理地*地將 +2 肽從 +1 肽中拉出 [下圖]。博索萊爾等人。（美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊 101(2004) 12130) 已經(jīng)使用這種方法從 HeLa 細(xì)胞裂解物的胰蛋白酶消化物中鑒定了 2000 多種磷酸肽。在各種研究中，一個(gè)非常復(fù)雜的胰蛋白酶消化物中大約 20-30% 的磷酸肽在這個(gè) +1 窗口中被洗脫。最近對(duì)這種方法的一個(gè)很好的研究是：JC Trinidad等人，Mol。細(xì)胞。蛋白質(zhì)組學(xué)5 (2006) 914。
在另一個(gè)交聯(lián)兩個(gè) +2 肽會(huì)產(chǎn)生凈電荷為 +4 的肽。因此，在非還原的胰蛋白酶消化物中，二硫鍵連接的肽比大多數(shù)其他肽的洗脫時(shí)間明顯晚。該方法已被用于選擇性地隔離它們。
膜和全細(xì)胞沉淀的問(wèn)題：
1) 溶解樣品。
2) 從所得溶液中除去脂質(zhì)。
3) 在隨后的分餾過(guò)程中將膜和結(jié)構(gòu)蛋白保持在溶液中。
此類樣品可在室溫下用 4:1 的 HFIP [純] 和濃溶液在幾分鐘內(nèi)溶解。甲酸 (96-98%)。膜蛋白也可以用丙醇或含有 HFIP 的乙腈提?。▍⒖嘉墨I(xiàn)：J. Carroll 等人，PNAS 103 (2006) 16170）。這些溶劑避免了去污劑對(duì)下游分析方法的干擾。所得溶液中的脂質(zhì)可以通過(guò) HILIC 模式下的 SPE 小柱去除；例如，item# SPEHY1203、TT200HEA 等。不保留脂質(zhì)（以及鹽和去污劑），但保留蛋白質(zhì)和肽。然后可以通過(guò)逐步增加水溶液來(lái)洗脫蛋白質(zhì)和肽。要在 IEX-HPLC 期間保持蛋白質(zhì)在溶液中，請(qǐng)使用 NaClO 4用于梯度并在流動(dòng)相中包括以下內(nèi)容：50 mM HFIP、20% ACN 和 20% PrOH。在情況下，使用 35% 的 ACN 和 35% 的 PrOH。或者，根據(jù)上述膜蛋白示例，在 HILIC 模式下使用PolyHYDROXYETHYL A™ 。
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ICAT®；iTRAQ®；MuDPIT :
ICAT: 如果您可以通過(guò)鑒定 2 或 3 個(gè)胰蛋白酶片段來(lái)確定蛋白質(zhì)的存在，那么鑒定其余部分是多余的。ICAT 的“AT"部分消除了蛋白質(zhì)中的大部分胰蛋白酶片段，從而可以從復(fù)雜的混合物中識(shí)別出更多的蛋白質(zhì)。在親和素柱親和純化之前，通常在PolySULFOETHYLA™上通過(guò) SCX 對(duì)完整的消化物進(jìn)行分級(jí)分離。這可以清理樣品并消除多余的 ICAT 試劑，否則可能會(huì)使親和素的結(jié)合能力飽和。
iTRAQ：這有助于測(cè)量相對(duì)豐度，但不一定以 ICAT 的方式簡(jiǎn)化混合物。與 iTRAQ 試劑反應(yīng)后，確保將 pH 值降至 3.0 或更低，并對(duì)混合物進(jìn)行脫鹽，以便在 SCX 中獲得良好的保留。
MuDPIT：參見上面關(guān)于在線與離線方法的討論。
蛋白質(zhì)組學(xué)策略中的常見缺陷：
1) 未能消除脂質(zhì)：這些會(huì)阻塞 RPC 柱并通常會(huì)產(chǎn)生干擾。使用 SPE-HILIC 小柱去除它們，或者使用含有 > 40% 有機(jī)溶劑的流動(dòng)相進(jìn)行離子交換。
2) 在胰蛋白酶消化過(guò)程中使用尿素、SDS 或 Gd.HCl：這些與 RPC 和/或 MS 不兼容。改用 30% 的 PrOH。參考：WK Russell等人 化學(xué)。73 (2001) 2682。
3) 胰蛋白酶化或 iTRAQ 反應(yīng)后未能調(diào)節(jié) pH：胰蛋白酶化和 iTRAC 衍生化在 pH 8 下進(jìn)行，而隨后的 SCX 在 pH 2.7-3.0 下進(jìn)行。未能調(diào)整 pH 值將導(dǎo)致樣品洗脫到空體積中。如果可能，使用 NH 4 HCO 3作為胰蛋白酶化緩沖液而不是 Tris，因?yàn)樗梢酝ㄟ^(guò)凍干法消除。
4) 樣品太咸：如果使用 SpeedVac® 去除 NH 4 HCO 3，將樣品連續(xù)干燥 3 次。對(duì) iTRAQ 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽比僅用 SCX 流動(dòng)相稀釋它們要好。
5) TFA 或 HFBA 的使用：一些作者建議在 SCX 的樣品溶劑或起始流動(dòng)相中使用它們。不！胰蛋白酶肽通常不保留在此類溶劑中。使用 5 mM KH 2 PO 4或 0.1% 甲酸或乙酸。6) SCX 色譜柱或毛細(xì)管過(guò)載： PolySULFOETHYLA™
色譜柱 每次進(jìn)樣推薦的最大肽裝載量如下：0.30-mm id，25µg；1.0 毫米內(nèi)徑，250µg；2.1 毫米內(nèi)徑，1.0 毫克；4.6 毫米內(nèi)徑，5 毫克。一些組超過(guò)這些水平高達(dá) 6 倍。這節(jié)省了勞動(dòng)力并產(chǎn)生了更濃縮的餾分。問(wèn)題：
a) 列通常持續(xù) 1/6 的時(shí)間。
b) 峰更寬。這意味著在每個(gè)收集的部分中會(huì)有更多的肽。RPC 毛細(xì)管可能過(guò)載，導(dǎo)致識(shí)別的肽百分比較小。
結(jié)論：為您的樣品使用足夠大的 SCX 色譜柱。
含 2µm 顆粒的色譜柱 （孔徑選項(xiàng)：-01、-03、-10）
| 列尺寸 | 項(xiàng)目編號(hào) | 價(jià)格 |
|---|---|---|
50×1.0mm | 051HY02-- | 530.00 |
100 x 1.0mm | 101HY02-- | 650.00 |
35 x 2.1 毫米 | 3.52HY02-- | 490.00 |
50 x 2.1 毫米 | 052HY02-- | 500.00 |
100 x 2.1 毫米 | 102HY02-- | 650.00 |
35 x 4.6 毫米 | 3.54HY02-- | 490.00 |
50 x 4.6 毫米 | 054HY02-- | 500.00 |
100 x 4.6 毫米 | 104HY02-- | 650.00 |
200 x 4.6 毫米 | 204HY02-- | 700.00 |
100 x 9.4 毫米 | 109HY02-- | 1320.00 |
200 x 9.4 毫米 | 209HY02-- | 2100.00 |
具有 3µm 顆粒的色譜柱 （孔徑選項(xiàng)：-006、-01、-03、-05、-10、-15）
| 列尺寸 | 項(xiàng)目編號(hào) | 價(jià)格 |
|---|---|---|
50×1.0mm | 051HY03-- | 490.00 |
100 x 1.0mm | 101HY03-- | 570.00 |
150 x 1.0mm | 151HY03-- | 635.00 |
35 x 2.1 毫米 | 3.52HY03-- | 470.00 |
50 x 2.1mm | 052HY03-- | 475.00 |
100 x 2.1 毫米 | 102HY03-- | 615.00 |
35 x 4.6 毫米 | 3.54HY03-- | 470.00 |
50 x 4.6 毫米 | 054HY03-- | 475.00 |
100 x 4.6 毫米 | 104HY03-- | 615.00 |
150 x 4.6 毫米 | 154HY03-- | 635.00 |
200 x 4.6 毫米 | 204HY03-- | 650.00 |
100 x 9.4 毫米 | 109HY03-- | 1200.00 |
200 x 9.4 毫米 | 209HY03-- | 1400.00 |
250 x 9.4 毫米 | 259HY03-- | 1500.00 |
300 x 9.4 毫米 | 309HY03-- | 1600.00 |
具有 5µm 顆粒的色譜柱 （孔徑選項(xiàng)：-006、-01、-02、-03、-05、-10、-15）
| 列尺寸 | 項(xiàng)目編號(hào) | 價(jià)格 |
|---|---|---|
50×1.0mm | 051HY05-- | 490.00 |
100 x 1.0mm | 101HY05-- | 570.00 |
150 x 1.0mm | 151HY05-- | 635.00 |
35 x 2.1 毫米 | 3.52HY05-- | 430.00 |
50 x 2.1mm | 052HY05-- | 445.00 |
100 x 2.1 毫米 | 102HY05-- | 520.00 |
200 x 2.1 毫米 | 202HY05-- | 615.00 |
35 x 4.6 毫米 | 3.54HY05-- | 430.00 |
50 x 4.6 毫米 | 054HY05-- | 445.00 |
100 x 4.6 毫米 | 104HY05-- | 520.00 |
150 x 4.6 毫米 | 154HY05-- | 565.00 |
200 x 4.6 毫米 | 204HY05-- | 615.00 |
250 x 4.6 毫米 | 254HY05-- | 630.00 |
100 x 9.4 毫米 | 109HY05-- | 960.00 |
200 x 9.4 毫米 | 209HY05-- | 1200.00 |
250 x 9.4 毫米 | 259HY05-- | 1280.00 |
250 x 21.0mm | 2521HY05-- | 3900.00 |
具有 12µm 顆粒的色譜柱 （孔徑選項(xiàng)：-006、-01、-03、-15）
| 列尺寸 | 項(xiàng)目編號(hào) | 價(jià)格 |
|---|---|---|
200 x 4.6 毫米 | 204HY12-- | 360.00 |
200 x 9.4 毫米 | 209HY12-- | 865.00 |
250 x 9.4 毫米 | 259HY12-- | 950.00 |
250 x 21.0mm | 2521HY12-- | 2700.00 |
250 x 50.8 毫米 | 2550HY12-- | 10500.00 |
具有 3µm 顆粒的毛細(xì)管* （孔徑選項(xiàng)：-006、-01、-02、-03、-05、-10、-15）**
| 毛細(xì)管尺寸 | 項(xiàng)目編號(hào) | 價(jià)格 |
|---|---|---|
50mm x 150µm | 050.15HY03-- | 450.00 |
100mm x 150µm | 100.15HY03-- | 500.00 |
150mm x 150µm | 150.15HY03-- | 550.00 |
50mm x 300µm | 050.30HY03-- | 450.00 |
100mm x 300µm | 100.30HY03-- | 500.00 |
150mm x 300µm | 150.30HY03-- | 550.00 |
**其他可用內(nèi)徑：75、100 和 200 µm。 | ||
| ** 2-µm 毛細(xì)管的價(jià)格與 3-µm 相同（孔徑為 -01、-03 和 -10）；將 2µm 的“03--"更改為“02--"。 | ||
帶有 5µm 顆粒的毛細(xì)管* （孔徑選項(xiàng)：-006、-01、-02、-03、-05、-10、-15）**
| 毛細(xì)管尺寸 | 項(xiàng)目編號(hào) | 價(jià)格 |
|---|---|---|
50mm x 150µm | 050.15HY05-- | 450.00 |
100mm x 150µm | 100.15HY05-- | 500.00 |
150mm x 150µm | 150.15HY05-- | 550.00 |
50mm x 300µm | 050.30HY05-- | 450.00 |
100mm x 300µm | 100.30HY05-- | 500.00 |
150mm x 300µm | 150.30HY05-- | 550.00 |
**其他可用內(nèi)徑：75、100 和 200 µm。 | ||
散裝材料 - 按克計(jì)價(jià)
粒徑 | 孔徑 | 項(xiàng)目編號(hào) | 價(jià)格/克 |
2微米 | -01, -03, -10 | BMHY02-- | 85.00（每 0.5 克） |
3微米 | -006、-01、-02、-03、-05、-10、-15 | BMHY03-- | 110.00 |
5微米 | -006、-01、-02、-03、-05、-10、-15 | BMHY05-- | 70.00 |
12微米 | -006、-01、-03、-15 | BMHY12-- | 26.00 |
20微米 | -01, -03, -15 | BMHY20-- | 26.00 |
30微米 | -03 | BMHY30-- | 26.00 |
固相萃取柱 - 10 包
項(xiàng)目編號(hào) 顆粒/孔徑 價(jià)格
保護(hù)墨盒 - （注意：需要可重復(fù)使用的支架。請(qǐng)參閱下面的列表）
（CPI 細(xì)節(jié)；內(nèi)螺紋入口，外
螺紋出口）
直接保護(hù)墨盒支架
（CPI 細(xì)節(jié)；內(nèi)螺紋入口，內(nèi)
螺紋出口）
Inline Guard 墨盒支架
（需要 CH10 支架）
（需要 CH10 支架）
（需要 CH10 支架）
