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      Invivogen pcpgf-bas說明書

       發(fā)布時間:2018/6/1 點擊量:585

      上海起發(fā)為InvivoGen國內(nèi)代理商,美國InvivoGen Invivogen 主要提供抗生素,轉(zhuǎn)染試劑,細(xì)胞因子,細(xì)胞系,質(zhì)粒等產(chǎn)品。抗生素涵蓋了細(xì)胞培養(yǎng)、篩選全系列,如Blasticidin S,Hygromycin B , Phleomycin, Primocin,   Zeocin等細(xì)胞分選常用抗生素。尤其以抗細(xì)胞支原體污染的抗生素Plasmocin™zui為出名,該抗生素因其性能受到客戶*。

      品牌:Invivogen

      貨號:pcpgf-bas

      品名:pCpGfree-basic with mSEAP reporter gene  帶有mSEAP報道基因的pCpGfree-basic

      規(guī)格:20 µg

       

      pCpGfree-basic是*不含CpG二核苷酸的報道質(zhì)粒。這些質(zhì)粒缺乏完整的啟動子區(qū)域(與pCpGfree質(zhì)粒相比)。

      pCpGfree-堿性質(zhì)粒在mSEAP或Lucia(一種分泌型熒光素酶報告基因)上游含有多克隆位點(MCS)。報道基因在用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的表達(dá)取決于在報道基因上游插入功能性啟動子或增強(qiáng)子/啟動子盒。

      因此,pCpGfree堿性質(zhì)粒允許單獨研究CpG甲基化對啟動子的影響,或與增強(qiáng)子元件組合。

       

      產(chǎn)品規(guī)格

      •不含CpG的質(zhì)粒骨架

      •不含增強(qiáng)子/啟動子區(qū)域的報告質(zhì)粒:

         - 鼠分泌的堿性磷酸酶(SEAP)

         - 分泌型熒光素酶(Lucia)

      •可在含Zeocin™的大腸桿菌中選擇

       

      本產(chǎn)品受限制使用許可(請參閱條款和條件)。

      內(nèi)容

      •提供20μg作為凍干DNA的pCpGfree-堿性質(zhì)粒

       

      •將大腸桿菌 GT115菌株凍干在紙盤上

       

      •4袋大腸桿菌 Fast- Media®Zeo(2 TB和2瓊脂)

       

      描述

      質(zhì)粒特征

      在大腸桿菌中復(fù)制和選擇質(zhì)粒所需的所有元件和哺乳動物細(xì)胞中的基因表達(dá)*沒有CpG二核苷酸。此外,所有Dam甲基化位點(GATC)已被去除以防止原核甲基化。

       

      用于在大腸桿菌中表達(dá)的元件

      •復(fù)制起點:大腸桿菌 R6K gamma ori已被修飾以去除所有CpG。該起源由pir基因編碼的R6K特異性啟動子蛋白π激活[1]。

      •細(xì)菌啟動子:EM2K是細(xì)菌EM7啟動子的無CpG版本。

      •選擇標(biāo)記:Zeocin™抗性基因是一個含有大量CpG二核苷酸的小基因(<400 bp)。一個合成的新等位基因被創(chuàng)建,不含CpGs。

       

      用于在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的元件

      •合成的mSEAPΔCpG基因:通過化學(xué)合成構(gòu)建的鼠SEAP基因的無CpG等位基因。

      •聚腺苷酸化信號:聚腺苷酸化信號是晚期SV40聚腺苷酸化信號的無CpG形式。

      MAR:基質(zhì)連接區(qū)域(MAR)是典型的富含AT的序列,能夠在獨立調(diào)控的結(jié)構(gòu)域之間形成屏障[2]。pCpGfree質(zhì)粒含有來自人IFN-β基因或β珠蛋白基因的5'區(qū)域的兩個MAR,因為它們天然不含CpG,所以被選擇。MARs被放置在細(xì)菌和哺乳動物轉(zhuǎn)錄單位之間。

      •MCS:多克隆位點包含幾個常用的限制性位點,以方便克隆感興趣的基因。5'Sda I,Bsp 120I,Avr II,Nsi I,Ppu 10I,Sca I,Bam HI,Spe I 3'

       

      由于存在R6Kγ復(fù)制起點,pCpGfree-basic只能在表達(dá)pir突變基因的大腸桿菌突變株中擴(kuò)增。它不會在標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌菌株中復(fù)制。因此,pCpGfree-basic與大腸桿菌 GT115菌株一起提供,該菌株也是Dcm甲基化缺陷的pir突變體。

       

      1. Wu F.等人 1995.對R6Kγ-起源核心復(fù)制子賦予穩(wěn)定維持的DNA片段。J Bacteriol。177(22):6338-45。

      2. Bode J.等,1996。支架/基質(zhì)附著區(qū):具有多種調(diào)節(jié)功能的拓?fù)溟_關(guān)。Crit Rev Eukaryot Gene Expr。圖6(2-3):115-38。

       

      細(xì)節(jié)

      基于pCpGfree的骨干

       

      MCS: 5'-SdaI,Bsp120I,AvrII,NsiI,Ppu10I,ScaI,BamHI,SpeI,HindIII-3'

       

      程序

      1-將啟動子和/或增強(qiáng)子片段插入pCpGfree-basic

      2-用CpG甲基化酶(Sss I)或位點特異性甲基化酶(Hha I,Hpa II)處理重組質(zhì)粒。

      3-用甲基化酶處理或未處理的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

      4-通過使用適當(dāng)?shù)臋z測試劑確定報告子表達(dá)來分析啟動子CpG甲基化。

       

       

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